Vliv na excitační světlo
Princip fluorometru je založen na vybuzení fluorescence pomocí působení excitačního světla o známé vlnové delce, intenzitě a délce působení.
Částice zákalu ve vzorku vody však ovlivňují excitační světlo a to dvěma způsoby. Část excitačního světla je absorbována a část záření je částicemi zákalu odražena, rozptylována. To způsobuje disproporce v intenzitě excitačního světla a ovlivňuje tak i výslednou očekvanou fluorescenční emisi. Do detektorů fluorescence se odráží zejména excitace v blízkosti 650 nm a 700 nm, neopak absorpční efekt je nejsilnější pro kratší vlnové délky kolem 470 nm. Nadhodnocení excitace mezi 590 nm a 610 nm pak může ve výsledku způsobovat odpovádající nadhodnocení koncetrnace sinic. Vysoké zákaly proto vedou k chybným stanovením. Mohou dokonce způsobit nadhodnocení koncetrace sinic díky detekci tzv. nexistujících "řasových důchů" (“ghost algae”), zatímco koncentrace zelených řas mohou být podhodnocené.
Přítomnost žlutých látek (fDOM - Fluorescent Dissolved Organic Matter) ve vzorku způsobuje opačný efekt, signál na 470 nm bývá zesílen, tedy je chybně očekáváno vyšší zastoupení zelených řas.
Vliv na fluorescenční signál
Na rozdíl od excitace se fluorescenční detekce vyhodnocuje výhradně při 700 nm. Přístroje Phyco line vyhodnocují signál na 650 nm a 700 nm. Vliv zákalu se projevuje především absorpcí a s tím souvisejícím zeslabením fluorescenčního signálu. Tuto situaci je téměř nemožné předcházet a tedy i přesně korigovat tento effekt v odpovídajícím způsobem. Tato chyba přetrvávala a byla chápana jako omezení pro tuto metodu stanovení. Protože tento efekt hraje hlavní roli při vysokých hodnotách zákalu přesahujících 150 FTU, může být pro zákal pod 150 FTU ignorován.
FluoroProbe
Volitelně se sondě bbe FluoroProbe může během stanovení v měřící cele současně měřit také propusnost - transmise vzorku. Do světelné dráhy přístroje je zabudována 700nm LED dioda, která přenáší světlo skrz vzorek na fotodetektor. To umožňuje přístroji detekovat velmi malé koncentrace zákalových látek s dobrou přesností a rozlišením.
AlgaeTorch
Bbe AlgaeTorch není, díky své odlišené konstrukci od bbe FluoroProbe, vybaven senzorem propusnosti - transmise. Proto je AlgaeTorch vybavena 700 nm LED paralelně s excitačními LED v přední části sondy. Zákal je měřen jako rozptýlené světlo pomocí fluorescenčního senzoru, kalibrovaného pro formazinové jednotky zákalu (FTU).
AlgaeLabAnalyser (ALA) a AlgaeOnlineAnalyser (AOA)
Měřící přístroje bbe AlgaeLabAnalyser (ALA) a AlgaeOnlineAnalyser (AOA) nejsou vybaveny 700 nm LED. Proto je propusnost - transmise určována pro všechny implementované vlnové délky 370 nm, 470 nm, 525 nm, 570 nm, 590 nm a 610 nm. Přístroje tedy detekují vliv zákalu přímo pro každou vlnovou délku.
Implementace korekce zákalu pro AlgaeLabAnalyser (ALA) a AlgaeOnlineAnalyser (AOA), FluoroProbe a AlgaeTorch
U těchto přístrojů je zákal dekódován jako propusnost - transmise. Pro korekci excitace je nutné nejprve převést hodnoty propusnosti - transmise na hodnoty zákalu v jednotkách FTU. Vztah mezi transmisí a zákalem lze popsat pomocí polynomu:
\[f(x)=a \times x^2 - b \times x + c\]
Přestože je propusnost - transmise předkalibrována přímo v přístroji, je vzorec univerzální pro převody ve všech fluorometrech bbe, stejně jako parametry a, b a c.
Po převedení transmise na zákal se korekce řídí stejným vzorem ve všech bbe fluorometrech.
V prvním kroku jsou korigovány specifické posuny (offsety) LED přístroje. Tímto způsobem mohou být korigován odrazy excitačního světla způsobené částicemi zákalu.
\[\text{offset corr.} = \text{turbidity} \times \text{LED brightness} \times \text{refflection constant} + \text{offset} \]
Výsledkem vzorce 2 je opravený offset. Hodnota zákalu bude násobena jasem LED a konstantou odrazu. Specifický offset přístroje (kalibrovaný v destilované vodě) bude sečten. "Otisky prstů" (speciální excitační spektra různých pigmentových systémů určujících třídy řas) obsahují skutečný jas LED. Je odvozen ze všech kalibrovaných "otisků prstů" a normalizován na 1 µg/l. Je uložen jako kalibrační specifická přístrojová konstanta v rámci sady parametrů pro každou jednotlivou LED.
Ve druhém kroku bude specifický hrubý signál LED korigován na zákal způsobený oslabením excitačního světla po odečtení zákalem korigovaného offsetu.
\[\text{raw value corr.} = (\text{raw value} - \text{offset corr.}) + (1 + \text{weakening constant(LED)} \times \text{turbidity} ) \]
Po korekci hrubých hodnot specifických pro jednotlivé LED jsou výsledky opatřeny "otisky prstů" tříd řas specifických pro daný přístroj. Klíčovým faktorem pro elimiaci chyb, které se objevují v důsledku neodpovídajícího fluorescenčního signálu, je korekce hrubých nezpracovaných (prvotních) hodnot signálů zákalu. Toho by nebylo možné dosáhnout opravou odečtů až po korekci, zvláště pokud by se zákal zbůsobený "řasovími důchy" (“ghost algae”) jevil jako sinice.
PhycoProbe
Světelná dráha bbe PhycoProbe se liší od konstrukce bbe FluoroProbe. Místo LED pro propusnost - transmisi obsahuje PhycoProbe druhý senzor pro fykocyanin 650 nm. Není proto vybavena senzorem pro propusnost - transmisi. Místo toho byla spolu s excitačními LED integrována také 700 nm LED dioda PhycoProbe byla dovybavena rozptylovým senzorem pro detekci zákalu. PhycoProbe je kalibrován pro formazinové jednotky zákalu (FTU).
PhycoLabAnalyser (PhycoLA) a PhycoSens
bbe PhycoLabAnalyser (PhycoLA) a PhycoSens implementují obě řešení, transmisní detekci pro všechny excitační vlnové délky a detekci rozptylu při 700 nm. Díky tomu jsou tato zařízení také velmi přesnými detektory zákalu s dvoustupňovou korekci zákalu.
Implementace korekce zákalu do bbe PhycoLabAnalyser (PhycoLA), PhycoSens a PhycoProbe
Již od vývoje nové řady bbe Phyco bylo dbáno na provedení korekce vlivů zákalu. Nejprve se upraví hrubé hodnoty podle modelu standardních fluorometrů pomocí předem definovaných parametrů.
V rámci řady bbe Phyco byl rozšířen nejen algoritmus přizpůsobení, ale také senzorová jednotka. Díky pokročilým možnostem se zákal stal dalším "otiskem prstu" podobně jako u žlutých látek nebo fykocyaninu, a proto součástí přizpůsobení. Tímto způsobem bylo možné dodatečně k efektům samotné svítivosti také korigovat barevné vlastnosti částic zákalu. V důsledku toho se fitování (přizpůsobení) stalo stabilnější a méně náchylné na nepřiměřený nezpracovaný signál.
Zdroj: